金相顯微鏡--顯微分光光度計

顯微分光光度計是—‘種在不同波長下測定顯微鏡標本成分光吸收的儀器、實質(zhì)上它是長期用于分析化學(xué)中的分光光度計與顯微鏡的結(jié)合。它可以用來測定細胞或細胞器內(nèi)一些重要的大分子物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）的含量，因此在繃qb化學(xué)和組織化學(xué)的定量研究中是一種*的工具。

金相顯微鏡--顯微分光光度計主要由光源、干涉濾片（或單色儀）、顯微饒、測量裝置和顯示控制系統(tǒng)等兒部分所組成＜圖16．4）。這種儀器具有雙重光源系統(tǒng)，一個觀察光源使用低壓白熾燈，用于觀察和聚焦顯微鏡標本；另一個是光度計光源，使用高壓氣體放電燈．用于標本的光度測量。光源連接有高度精密的穩(wěn)壓供電系統(tǒng)，一般輸出電壓的變化控制在o．033％以內(nèi)。用于分光光度術(shù)的顯微鏡是高性能的專門研究顯微鏡，它可以組裝雙重光源和測旦裝置，并且在光度計筒內(nèi)具有一個特殊的測量光闌，光闌的直徑可以改變，直到可以測量直徑為1μm大小的測量區(qū)域，測量光闌可以根據(jù)被測物體的形狀選用圓形、八角形、方形或矩形的。

金相顯微鏡--顯微分光光度計由于生物標本中被測定的不問物質(zhì)在光譜吸收曲線上有特異的吸收高峰，因此在測定某一物質(zhì)時，必須使用能夠產(chǎn)生很窄光譜區(qū)域光的于涉濾片。這種干涉蹈片分為兩種，一種是窄通帶干涉濾片，帶寬為o．5一15nm，另一種是宛通帶干涉濾片，帶寬為15—18nm。能夠產(chǎn)嫂單色光的比較理想的另一種裝置是單色儀（圖16．；中的3），它誣道光柵（或棱鏡）散射來自具有連續(xù)發(fā)射光譜的強光源的光，然后在一定的光譜范圍（200一1，ooonm）內(nèi)可以任意選擇具有很窄帶寬的單色光，在單色僅中波長范圍的調(diào)節(jié)*是自動的，因此通過標本光的波長可以迅速靈活地改變，使用非常方便。在使用單色儀時，通過調(diào)節(jié)，使單色儀出縫的像成在孔徑光鬧的平面上，并且讓孔徑光闌正好充滿單色儀的出縫。出縫的寬度可以選擇，但從圖16．6沖單色儀波長選擇刻度盤上可以看出，出縫放寬，單色光的帶寬愈大。當(dāng)出縫寬度為o．5mm時，帶覽為3．3nm，當(dāng)比縫為3mm時，帶竟則為19。8nm。

圖16．6可以說明顯微分光光度計的使用原理，兩條光譜吸收曲線I和Ⅱ是在顯微分光光度計上，用通過火蛇紅血細胞的細胞質(zhì)和細胞核的直徑為lvm的光點進行測量而記錄的。在這種紉胞的細胞質(zhì)中血紅蛋白的出現(xiàn)引起丁近545nm處的*個吸收高峰，而更高的第二個局峰出現(xiàn)在416nm處；在紫外光區(qū)域出現(xiàn)吸收的*次下降，在300一320nm處又回升出現(xiàn)3個高波。在細胞核的吸收曲線（Ⅱ）中，在416nm處也觀察到•—個吸收高煉，但這并不是細胞核本身的吸收，而是由于分市在光束所要通過的細胞核．上面和下面的細胞質(zhì)中大量的血紅蛋白所引起的；在較短波長曲紫外光范圍內(nèi)，在260nm范圍可以觀察到非常明顯的zui大吸收值，這個范圍的吸收除了蛋白質(zhì)的吸收以外，zui主要的足由細胞核中高濃度的核酸在260nm處的特異吸收所引起的。

金相顯微鏡--由于在顯微分光光度計中，通過標本的光束在大多數(shù)情況下直徑只有一至幾個Mm，因此要記錄這樣一個小光點的非常微弱的信號就需要非常強的放大裝置，現(xiàn)在一般使用光電倍增管。光電倍增管可以把微弱的光信號變?yōu)殡娏鳎⑶夷軌蚍糯?0‘一10’倍，因此它的靈敏度是非常高的。測量的結(jié)果可以通過顯示系統(tǒng)以數(shù)字顯示出來，或者通過電傳打字記錄下來。

作為分光光度計的基本原理也適用于顯微分光光度計，當(dāng)光線迎過物質(zhì)標本的單色溶液時，除了少量的反射和散射而外，一部分光被吸收過。透射光密度（11）與入射光密度（1o）的比值被稱為透射串（T），—種具有光吸收而剩余的光透在一定的條件下，例如當(dāng)溶液為單色并且不存在濃度放應(yīng)時，透射率倒數(shù)的以10為底的對數(shù)與生色物質(zhì)的濃度成比例關(guān)系，這個數(shù)值被稱為消光值（E）。

金相顯微鏡--在顯微分光光度計上所進行的生物標本中光吸收物質(zhì)的測定就遠還沒有如此簡單，即就是當(dāng)染料（或天然色素）具有己知的吸收光譜并且服從于郎伯一比爾定律時也是非常復(fù)雜的。在這種生物標本中不僅光學(xué)密度是*異質(zhì)的，而義它的形狀是不規(guī)則的，光程長也是不清楚的。只有當(dāng)被測物體的形狀是規(guī)則的幾何形狀時才接近于比色槽的情況，這種情況出現(xiàn)在具有球體形狀的細胞核中。在理論上，一個用字爾根法染色的細胞核可以看作是未染色的細胞質(zhì)中在球形比色槽內(nèi)的堿性品紅染料的溶胚。

對于生物學(xué)標本的顯微分光光度測量會受到一種分初誤差的影響，這種誤差是由于生物物質(zhì)的不均勻分布所造成的，在有些情況下這種誤差可能是相當(dāng)大的。因此在顯微分光光度術(shù)中，一般可以來用掃描法、雙波法、——波雙區(qū)法等幾種方法克服生色物質(zhì)分布的不均勻性效果，從而可以在一定程度上解決分稍誤差的問題。在使用自動掃描儀器時，物體可以被分割為很小的區(qū)域，因此可以把每個小區(qū)域當(dāng)作是均質(zhì)的，這樣采用綜合一系列的消光值讀數(shù)，對于整個生色物質(zhì)來說就可以得到一個總的消光值。

金相顯微鏡--顯微分光光度計使用一種新型的像掃描或標本掃描儀器和積分顯微光度計，并且盡量避免不同來源的誤差時，就可以以一定的重復(fù)性直接測定游離的紅血細胞中30pg（30×10-12克）的血紅蛋白的員；并且可以通過特殊的罕爾根染色反應(yīng)以同樣的準確度和精密度測定細胞核中的DNA，也可以通過對于蛋白質(zhì)干擾的矯正在天然吸收的基礎(chǔ)上對核酸進行測定。

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